![[community profile]](https://www.dreamwidth.org/img/silk/identity/community.png){kind=small}
![[personal profile]](https://www.dreamwidth.org/img/silk/identity/user.png){kind=small}
parohАвтор: Д-р Карлос Маскус Лопес
Координатор, молекулярная биология и вычислительный отдел, университет Антиокии PECET
20 марта 2018 г.
Кратко
Исследователи Drug Search for Leishmaniasis ( поиск лекарств от лейшманиоза ) недавно провели лабораторные исследования на 10 соединениях. Тестирование показало, что ни одно из соединений не было хорошей потенциальной терапией и исследователи обратят свое внимание на дополнительные соединения.
Москиты, такие как P. papatasi, показанный выше, несут ответственность за распространение лейшманиоза.
Лейшманиоз является одной из самых обделенных вниманием тропических болезней в мире, заразив более двух миллионов человек в 98-ми странах. Современные методы лечения всех форм лейшманиоза могут вызывать серьезные побочные эффекты, включая смерть. Кроме того, устойчивые к лекарствам паразиты вызывают серьезные проблемы во многих странах. По этим причинам существует настоятельная необходимость в новых, безопасных и недорогих лекарственных препаратах.
Команда The Drug Search for Leishmaniasis продолжила свое лабораторное тестирование со времени их последней новости. В последнем раунде тестирования было задействовано 10 соединений, которые были идентифицированы как потенциальные, чтобы стать более безопасными, более эффективными методами лечения.
Соединения сначала тестировали на токсичность, затем на эффективность против двух общих паразитов, которые могут вызывать лейшманиоз. Исходя из результатов тестирования, ни одно из тестируемых соединений не будет эффективным методом лечения этого заболевания.
Исследователи сделают эти результаты публичными, как они сделали с их данными на сегодняшний день. Это будет предупреждать других ученых о том, что эти конкретные соединения не эффективны против лейшманиоза и поможет им принять решение о тестировании других соединений. Как только команда получит дополнительное финансирование, они проведут тестирование дополнительных соединений, которые могут быть полезны при лечении лейшманиоза.
Любой, кто интересуется полным научным описанием этого последнего раунда тестирования, может быть читать дальше. Спасибо всем, кто поддержал этот проект.
Чтобы определить, смогут ли предсказанные in silico молекулы с потенциальной лейшманицидной активностью пройти анализ in vivo, молекулы должны сначала пройти тестирование цитотоксичности на клетки человека in vitro. Затем оценивают те молекулы, которые показывают низкую или отсутствующую цитотоксичность, для ингибирования роста паразита в макрофагах человека и эффективной концентрации 50 (EC50). EC50 представляет собой концентрацию молекулы, которая убивает 50% паразитов in vitro.
Цитотоксическую активность соединений оценивали на линии клеток человека U937 (CRL-1593-2 ™ АТСС). Для оценок клетки использовали в логарифмической фазе роста и культивировали в 96-луночных культуральных планшетах в концентрации 100 000 клеток/мл для U937 в среде RPMI-1640, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (SFB) и 1% антибиотиков (пенициллин-стрептомицин) (Sigma). Шесть серийных разведений, приготовленных из каждой из следующих концентраций: 200 - 100 - 50 - 25,0 и 1 мкг/мл получали согласно соединению, подлежащему оценке. Клетки инкубировали при 37°С с 5% СО2 в течение 72 часов в присутствии соединений и, впоследствии, эффект определяли с использованием метода фермента МТТ. Этот метод использует краситель, метаболизирующий живые клетки, уменьшая окраску, которая измеряется как «оптическая плотность» (OD). Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение еще 30 минут и образование формазана (изменение цвета) измеряли при 570 нм на спектрофотометре. В качестве контроля жизнеспособности, клетки, культивируемые в тех же условиях инкубации, использовали в отсутствие соединений. Доксорубицин использовали в качестве контроля цитотоксичности.
Цитотоксичность определяли в соответствии с процентным снижением жизнеспособности и, следовательно, уменьшением количества клеток, полученных для каждого соединения и доксорубицина, в соответствии с величинами OD, полученными в каждом экспериментальном состоянии. Снижение жизнеспособности клеток было рассчитано с использованием значений OD для каждого условия, то есть соединения или контроля в оцениваемой концентрации, с использованием следующего уравнения: % Жизнеспособность = [OD клеток, подвергаемых воздействию соединения или контрольной клетки / OD незадействованных клетки] × 100). Значения OD, полученные для клеток в отсутствие соединений, соответствуют 100% жизнеспособности или живым клеткам. Затем, с процентами жизнеспособности, был рассчитан процент смертности, который соответствует 100% жизнеспособности. Со значениями смертности смертельная концентрация 50 (LC50) была рассчитана программой Probit3. Цитотоксичность каждого соединения классифицировали в соответствии со значениями LC50 с использованием запатентованной шкалы: высокая цитотоксичность LC50 <50 мкг/мл; умеренная цитотоксичность: 50 < LC50 < 200 мкг/мл и низкая цитотоксичность: LC50 > 200 мкг/мл.
В таблице 1 показаны результаты цитотоксичности, где отмечается, что одно соединение показало низкую цитотоксичность, в то время как три имели умеренную цитотоксичность для линии клеток человека U937. Как и ожидалось, доксорубицин, включенный в качестве контроля токсичности, показал высокую цитотоксичность.
Таблица 1. Оценка цитотоксичности in vitro
Перед определением эффективной концентрации 50 (ЕС50) все соединения были предварительно выбраны путем оценки влияния на процент заражения во внутриклеточных амастиготах в клеточной линии U-937 по сравнению с контрольными амастиготами в отсутствие соединения.
В этом тесте лейшманицидной активности in vitro использовали флуоресцентные штаммы Leishmania panamensis (UA140-pIR (-) - eGFP) и Leishmania braziliensis (UA301-pIR (-) - eGFP).
Активность соединений оценивали на внутриклеточных паразитах (стадии амастиготы), полученных после инфицирования макрофагов in vitro. Клетки U-937 инфицировали флуоресцентными промастиготами в стационарной фазе роста при соотношении паразитов и клеток 30:1 для штамма Leishmania panamensis UA140 и 20:1 для штамма Leishmania braziliensis UA301. Зараженные клетки подвергали различной концентрации соединений в течение 72 часов (см. Концентрации, используемые для каждого соединения, в примечании ниже таблицы 2). В качестве контроля инфекции инфицированные клетки использовали в отсутствие соединений, а амфотерицин В использовали в качестве положительного контроля. После 72 часов инкубации клетки осторожно удаляли со дна чашки и анализировали в проточном цитометре, считывая при 488 нм возбуждении и 525 нм эмиссии с помощью Argon4-лазера.
Активность против лейшмании определялась на основе нагрузки паразита, которая представляет собой количество паразитов в инфицированных клетках, подвергнутых воздействию концентрации, выбранной для каждого соединения или амфотерицина B. Снижение нагрузки паразита, называемое ингибированием инфекции, рассчитывали с использованием флуоресценции средние значения интенсивности (MFI) и с использованием следующей формулы: %Инфекция = [клетки MFI, инфицированные и подвергающиеся воздействию соединения или амфотерицина B/MFI, инфицированного неэкспонированными клетками] × 100). Значения MFI, полученные для инфицированных клеток в отсутствие лекарственного средства или соединения, соответствуют 100% инфекции. В свою очередь, процент ингибирования инфекции соответствует 100% инфекции -% инфекции при наличии соединения.
Таблица 2. Оценка процента ингибирования, полученного с испытуемыми соединениями во внутриклеточных паразитах.
EC50 не определялся ни для одной из молекул, потому что ни одно из соединений не показало процент ингибирования, превышающий 50% у двух видов Leishmania (см. Таблицу 2).
Заключение
Ни одна из 10 оцениваемых молекул не показала многообещающих результатов против лейшманиоза, основанных на анализах ингибирования цитотоксичности in vitro. И учитывая это, EC50 не вычислялась.
новость на англ.
З.Ы. без понятия, как выравнивать таблицы и текст.
Координатор, молекулярная биология и вычислительный отдел, университет Антиокии PECET
20 марта 2018 г.
Кратко
Исследователи Drug Search for Leishmaniasis ( поиск лекарств от лейшманиоза ) недавно провели лабораторные исследования на 10 соединениях. Тестирование показало, что ни одно из соединений не было хорошей потенциальной терапией и исследователи обратят свое внимание на дополнительные соединения.
Москиты, такие как P. papatasi, показанный выше, несут ответственность за распространение лейшманиоза.
Краткое описание последних результатов рабочей группы
Лейшманиоз является одной из самых обделенных вниманием тропических болезней в мире, заразив более двух миллионов человек в 98-ми странах. Современные методы лечения всех форм лейшманиоза могут вызывать серьезные побочные эффекты, включая смерть. Кроме того, устойчивые к лекарствам паразиты вызывают серьезные проблемы во многих странах. По этим причинам существует настоятельная необходимость в новых, безопасных и недорогих лекарственных препаратах.
Команда The Drug Search for Leishmaniasis продолжила свое лабораторное тестирование со времени их последней новости. В последнем раунде тестирования было задействовано 10 соединений, которые были идентифицированы как потенциальные, чтобы стать более безопасными, более эффективными методами лечения.
Соединения сначала тестировали на токсичность, затем на эффективность против двух общих паразитов, которые могут вызывать лейшманиоз. Исходя из результатов тестирования, ни одно из тестируемых соединений не будет эффективным методом лечения этого заболевания.
Исследователи сделают эти результаты публичными, как они сделали с их данными на сегодняшний день. Это будет предупреждать других ученых о том, что эти конкретные соединения не эффективны против лейшманиоза и поможет им принять решение о тестировании других соединений. Как только команда получит дополнительное финансирование, они проведут тестирование дополнительных соединений, которые могут быть полезны при лечении лейшманиоза.
Любой, кто интересуется полным научным описанием этого последнего раунда тестирования, может быть читать дальше. Спасибо всем, кто поддержал этот проект.
Оценка in vitro антилейшманиозной активности предсказанных молекул путем стыковки
Чтобы определить, смогут ли предсказанные in silico молекулы с потенциальной лейшманицидной активностью пройти анализ in vivo, молекулы должны сначала пройти тестирование цитотоксичности на клетки человека in vitro. Затем оценивают те молекулы, которые показывают низкую или отсутствующую цитотоксичность, для ингибирования роста паразита в макрофагах человека и эффективной концентрации 50 (EC50). EC50 представляет собой концентрацию молекулы, которая убивает 50% паразитов in vitro.
Оценка цитотоксичности
Цитотоксическую активность соединений оценивали на линии клеток человека U937 (CRL-1593-2 ™ АТСС). Для оценок клетки использовали в логарифмической фазе роста и культивировали в 96-луночных культуральных планшетах в концентрации 100 000 клеток/мл для U937 в среде RPMI-1640, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (SFB) и 1% антибиотиков (пенициллин-стрептомицин) (Sigma). Шесть серийных разведений, приготовленных из каждой из следующих концентраций: 200 - 100 - 50 - 25,0 и 1 мкг/мл получали согласно соединению, подлежащему оценке. Клетки инкубировали при 37°С с 5% СО2 в течение 72 часов в присутствии соединений и, впоследствии, эффект определяли с использованием метода фермента МТТ. Этот метод использует краситель, метаболизирующий живые клетки, уменьшая окраску, которая измеряется как «оптическая плотность» (OD). Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение еще 30 минут и образование формазана (изменение цвета) измеряли при 570 нм на спектрофотометре. В качестве контроля жизнеспособности, клетки, культивируемые в тех же условиях инкубации, использовали в отсутствие соединений. Доксорубицин использовали в качестве контроля цитотоксичности.
Цитотоксичность определяли в соответствии с процентным снижением жизнеспособности и, следовательно, уменьшением количества клеток, полученных для каждого соединения и доксорубицина, в соответствии с величинами OD, полученными в каждом экспериментальном состоянии. Снижение жизнеспособности клеток было рассчитано с использованием значений OD для каждого условия, то есть соединения или контроля в оцениваемой концентрации, с использованием следующего уравнения: % Жизнеспособность = [OD клеток, подвергаемых воздействию соединения или контрольной клетки / OD незадействованных клетки] × 100). Значения OD, полученные для клеток в отсутствие соединений, соответствуют 100% жизнеспособности или живым клеткам. Затем, с процентами жизнеспособности, был рассчитан процент смертности, который соответствует 100% жизнеспособности. Со значениями смертности смертельная концентрация 50 (LC50) была рассчитана программой Probit3. Цитотоксичность каждого соединения классифицировали в соответствии со значениями LC50 с использованием запатентованной шкалы: высокая цитотоксичность LC50 <50 мкг/мл; умеренная цитотоксичность: 50 < LC50 < 200 мкг/мл и низкая цитотоксичность: LC50 > 200 мкг/мл.
В таблице 1 показаны результаты цитотоксичности, где отмечается, что одно соединение показало низкую цитотоксичность, в то время как три имели умеренную цитотоксичность для линии клеток человека U937. Как и ожидалось, доксорубицин, включенный в качестве контроля токсичности, показал высокую цитотоксичность.
Таблица 1. Оценка цитотоксичности in vitro
Имя соединения |
CL50% мкг/мл X + SD |
|
|
линия клеток U-937 |
уровень токсичности |
ZINC12005520 |
16.5 ± 0.8 |
высокий |
ZINC16626805 |
135.7 ± 2.9 |
средний |
ZINC17135526 |
12.8 ± 1.8 |
высокий |
ZINC08598759 |
3.4 ± 0.8 |
высокий |
ZINC32951205 |
3.7 ± 1.3 |
высокий |
ZINC32951223 |
27.1 ± 6.1 |
высокий |
ZINC08587552 |
0.5 ± 0.6 |
высокий |
ZINC08971918 |
65.6 ± 7.4 |
средний |
ZINC04777075 |
>200 |
низкий |
ZINC18222288 |
53.8 ± 3.0 |
высокий |
Доксорубицин (контроль) |
0.5 ± 0.1 |
высокий |
Оценка анти-лейшманицидной активности
Перед определением эффективной концентрации 50 (ЕС50) все соединения были предварительно выбраны путем оценки влияния на процент заражения во внутриклеточных амастиготах в клеточной линии U-937 по сравнению с контрольными амастиготами в отсутствие соединения.
В этом тесте лейшманицидной активности in vitro использовали флуоресцентные штаммы Leishmania panamensis (UA140-pIR (-) - eGFP) и Leishmania braziliensis (UA301-pIR (-) - eGFP).
Активность соединений оценивали на внутриклеточных паразитах (стадии амастиготы), полученных после инфицирования макрофагов in vitro. Клетки U-937 инфицировали флуоресцентными промастиготами в стационарной фазе роста при соотношении паразитов и клеток 30:1 для штамма Leishmania panamensis UA140 и 20:1 для штамма Leishmania braziliensis UA301. Зараженные клетки подвергали различной концентрации соединений в течение 72 часов (см. Концентрации, используемые для каждого соединения, в примечании ниже таблицы 2). В качестве контроля инфекции инфицированные клетки использовали в отсутствие соединений, а амфотерицин В использовали в качестве положительного контроля. После 72 часов инкубации клетки осторожно удаляли со дна чашки и анализировали в проточном цитометре, считывая при 488 нм возбуждении и 525 нм эмиссии с помощью Argon4-лазера.
Активность против лейшмании определялась на основе нагрузки паразита, которая представляет собой количество паразитов в инфицированных клетках, подвергнутых воздействию концентрации, выбранной для каждого соединения или амфотерицина B. Снижение нагрузки паразита, называемое ингибированием инфекции, рассчитывали с использованием флуоресценции средние значения интенсивности (MFI) и с использованием следующей формулы: %Инфекция = [клетки MFI, инфицированные и подвергающиеся воздействию соединения или амфотерицина B/MFI, инфицированного неэкспонированными клетками] × 100). Значения MFI, полученные для инфицированных клеток в отсутствие лекарственного средства или соединения, соответствуют 100% инфекции. В свою очередь, процент ингибирования инфекции соответствует 100% инфекции -% инфекции при наличии соединения.
Таблица 2. Оценка процента ингибирования, полученного с испытуемыми соединениями во внутриклеточных паразитах.
Name of Product |
% ингибирования X + SD |
|
|
L. panamensis UA140 |
L. braziliensis UA301 |
ZINC12005520 |
19.0 ± 3.0 |
2.6 ± 0.5 |
ZINC16626805 |
0 |
17.3 ± 6.5 |
ZINC08598759 |
12.3 ± 1.9 |
38.6 ± 1.2 |
ZINC32951205 |
8.0 ± 0.9 |
29.4 ± 6.6 |
ZINC32951223 |
1.2 ± 0.4 |
0 |
ZINC08587552 |
6.6 ± 3.3 |
0.3 ± 0.5 |
ZINC08971918 |
0 |
3.0 ± 5.9 |
ZINC04777075 |
0 |
33.4 ± 4.2 |
ZINC18222288 |
0 |
14.3 ± 5.0 |
Амфотерицин B-Control |
75.9 ± 5.5 |
71.6 ± 5.1 |
EC50 не определялся ни для одной из молекул, потому что ни одно из соединений не показало процент ингибирования, превышающий 50% у двух видов Leishmania (см. Таблицу 2).
Заключение
Ни одна из 10 оцениваемых молекул не показала многообещающих результатов против лейшманиоза, основанных на анализах ингибирования цитотоксичности in vitro. И учитывая это, EC50 не вычислялась.
новость на англ.
З.Ы. без понятия, как выравнивать таблицы и текст.
![[identity profile]](https://www.dreamwidth.org/img/silk/identity/openid.png){kind=small}
